蛋白质测定的原理和方法一、粮油及其制品中蛋白质的测定蛋白质的测定方法一般是根据蛋白质的理化特性来确定的，主要分为两类：一类是利用蛋白质共性的方法，例如凯氏法、双缩脲法等；另一类是利用蛋白质中含有特定氨基酸残基的方法，例如酚试剂法、紫外光谱吸收法、色素结合法等。在粮食品质分析中应用最普遍的是凯氏法。该法是年由丹麦化学家凯道尔创立的，适宜于测定任何形态的样品，而且具有很高的准确度和精密度，一直被作为蛋白质定量的标准方法。近几年来对凯氏法进行了多方面的改进，目前正向自动检测方面发展。1、常量凯氏定氮法1）原理：将含有蛋白质的样品与浓H2SO4共热，其中的氮变成铵盐状态后再与浓碱作用，放出的氨用酸吸收，滴定剩余的酸，即可算出含氮量。具体测定步骤可用消化、蒸馏、吸收与滴定来概括。消化是指将蛋白质与浓H2SO4混合加热，蛋白质被分解，其中的碳被氧化成CO2，所含的氮则转变成氨，并与H2SO4化合形成硫酸铵残留于消化液中。2NH2（CH2）2COOH＋13H2SO4＝（NH4）2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O由于上述反应进行很慢，消化需要很长时间，加入催化剂可加快反应速度，CuSO4是常用的催化剂，K2SO4能提高溶液的沸点，常将它们混合使用，起加速氧化、促进有机物分解的作用。K2SO4的用量不宜过大，否则温度过高，生成的（NH4）2SO4会分解，放出氨，使氮损失。蒸馏是将消化所得的（NH4）2SO4加碱蒸馏，氨又被释放出来。2NaOH＋（NH4）2SO4＝2NH3＋Na2SO4＋2H2O需要注意的是加入NaOH溶液要过量，而且要防止样液中NH3的逸出。可用CuSO4作碱性指示剂，以黑色CuO出现为宜吸收与滴定是将生成的氨用标准HCl吸收，剩余的未被中和的HCl则用标准NaOH溶液滴定。所用HCl的摩尔数减去滴定所消耗的NaOH的摩尔数，就是被吸收氨的摩尔数生成的氨也可直接用硼酸溶液吸收。硼酸吸收氨后，指示剂的颜色变化，再用HCl滴定，直至恢复到原来的氢离子浓度为止，用去HCl的摩尔数即相当于样品中氨的摩尔数2NH3＋4H3BO3＝（NH4）2B4O7＋5H2O（NH4）2B4O7＋5H2O＋2HCl＝2NH4Cl＋4H3BO3由于各种蛋白质中氮的质量分数通常为16%左右，将氮的质量分数乘以蛋白质系数，即得粗蛋白质的质量分数。2）仪器：凯氏烧瓶（ml）、锥形瓶（ml）、定管（50ml）、移液管（50ml）、量筒（ml）、定氮蒸馏装置3）试剂：浓、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：5份1g/l溴甲酚绿乙醇溶液与1份甲基红乙醇溶液，按5：1体积临用时混合、40g/l硼酸吸收液：称取20g硼酸溶解于ml热水中，摇匀备用、0.0mol/LHCl标准溶液4）操作方法准确称取固体样品0.2~2g（半固体样品2~5g，液体样品10~20ml），小心移入干燥洁净的ml凯氏烧瓶中，加入研细的CuSO40.5g，K2SOg和浓H2SOml，轻轻摇匀，安装消化装置，并将其以45°斜支于有小孔的石棉网上。用电炉以小火加热，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后，加大火力，使瓶内液体微沸，液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。冷却，小心加入ml蒸馏水，再放冷，加入玻璃珠数粒以防蒸馏时爆沸。将凯氏瓶安装好蒸馏装置，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内预先装入50ml40g/l硼酸吸收液及混合指示剂2~3滴）。放松夹子，通过漏斗加入70~80mlg/LNaOH溶液，并摇动凯氏烧瓶，瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀后，再加入ml蒸馏水（从漏斗中加入），夹紧夹子，加热蒸馏，至氨全部蒸出（馏液约ml即可），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以奈氏试剂检查，若无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。否则应继续蒸馏。将上述吸收液用0.0mol/LHCl标准溶液直接滴定至灰色即为终点，记录HCl标准溶液的用量。同时做空白试验（除不加样品外，其他操作完全相同），记录空白试验消耗HCl标准溶液的体积。5）结果计算蛋白质质量分数的计算公式为w（蛋白质）＝〔M×F×c(v1－v2)×〕/（0×m）＝〔F×c(v1－v2)×1.4〕/m式中：w(蛋白质)——蛋白质的质量分数（%）m——样品的质量（g）M/14——氮的摩尔质量（g/mol）c——HCl标准溶液的浓度（mol/L）v1——滴定样品吸收液时消耗HCl标准溶液的体积（ml）v2——滴定空白吸收液时消耗HCl标准溶液的体积（ml）F——氮换算为蛋白质的系数蛋白质中氮的质量分数一般为15~17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质的质量分数。蛋白质系数：乳制品为6.38；肉及其制品为6.25；玉米、高粱为6.24；米为5.95；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；大豆及其制品为5.71；面粉为5.70；花生为5.46；芝麻、向日葵为5.）注意事项蒸馏装置不能漏气；蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色，不生成Cu（OH）2沉淀，此时需增加NaOH的用量；硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用；蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸；所有试剂溶液应用无氨蒸馏水配制；消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，注意不断转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全；样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫逸出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不断摇动；也可以加入少量的辛醇、液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度；当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%（体积分数）H2O22~3ml后再继续加热消化；若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加H2SO4用量；一般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以消化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需延长消化时间。有机物若分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色；混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。2、微量凯氏定氮法1）原理：同常量凯氏定氮法2）仪器和用具：凯氏烧瓶（ml）、万用电炉、微量滴定管（10ml）、移液管（10ml）、容量瓶（ml）、洗耳球、乳胶管、微量凯氏定氮蒸馏装置3）试剂：0.00mol/LHCl标准溶液：其他试剂同常量凯氏定氮法4）操作方法：样品消化步骤同常量凯氏定氮法将消化完全的溶液冷却后，全部移入ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。装好微量定氮装置。量取消化稀释液10ml置于反应管内，经漏斗再加入10mlg/LNaOH溶液使其呈强碱性，用少量蒸馏水冲洗漏斗数次，夹好漏斗夹，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10ml40g/l（或20g/l）硼酸吸收液的液面下。蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10min后，将冷凝管下端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。馏出液用0.00mol/LHCl标准溶液滴定至灰色为终点。同时做空白试验。5）结果计算样品中蛋白质质量分数的计算公式为w（蛋白质）＝｛〔F×c(v1－v2)×14×〕/0｝/〔（10×m）/〕＝F×c(v1－v2)×14/m式中：w(蛋白质)——样品中蛋白质的质量分数（%）m——样品的质量或体积（g）14/M——氮的摩尔质量（g/mol）c——HCl或H2SO4标准溶液的物质的量的浓度（mol/L）v1——样品消耗HCl或H2SO4标准溶液的体积（ml）v2——试剂空白消耗HCl或H2SO4标准溶液的体积（ml）F——氮换算为蛋白质的系数6）说明20g/L硼酸吸收液每次用量25ml，用前加入甲基红-溴甲酚绿混合指示剂2滴；在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断气，否则将发生倒吸；加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失；双试验结果允许误差：粗蛋白质的质量分数在15%以下时，不超过0.2%；蒸馏前将水蒸气发生器内装水至2/3体积处，加甲基橙指示剂数滴及H2SO4数毫升以使其始终保持酸性，可避免水中的氨被蒸出而影响测定结果；粗蛋白质的质量分数在15%以上时，误差不超过0.4%。求其平均数，即为测定结果，测定结果取小数点后一位。二、饮料中蛋白质的测定1、原理：同“粮油及其制品中蛋白质的测定”中的常量凯氏定氮法。2、仪器：同“粮油及其制品中蛋白质的测定”中的常量凯氏定氮法。3、试剂：同“粮油及其制品中蛋白质的测定”中的常量凯氏定氮法。4、测定方法：准确吸取饮料样品10~20ml，移入干燥洁净的ml凯氏烧瓶中，加入研细的CuSO40.5g、K2SOg和浓H2SOml，轻轻摇匀，安装消化装置，并将其以45°斜支于有小孔的石棉网上。用电炉以小火加热，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。冷却，加入ml蒸馏水，再放冷，加入玻璃珠数粒以防蒸馏时爆沸。原文

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