1.冷冻扫描电镜总结

老例扫描电镜请求所观测的样本无水，而一些样本在枯燥过程中会产生布局变动，以致没法观测其可靠布局。冷冻扫描电镜技巧也许对含水(溶剂)样本施行成像和解析，实行关于液态样本(如乳液、囊泡等)及不耐电子束损伤样本的宏观描写的观测。在冷冻扫描电镜观测前，液态样本经太低温冷冻中止、断裂、镀膜(喷金/喷碳)等制样责罚后，再经历冷冻传输系统将其置于电镜内的冷台（温度可至-℃便可施行观测。此中，加紧冷冻技巧也许使水在低温形态下呈玻璃态，增加冰晶的造成，进而不影响样本自身布局，冷冻传输系统保证样本传输过程中维持低温形态，全面系统从制样到观测都在低温下施行，尽也许维持样本在液相中的原位布局。

2.系统构成及过程

冷冻扫描电镜系统包罗冷冻中止、冷冻断裂、升华及导电性喷涂等制样摆设，冷冻传输安设及扫描电镜的冷台，样本首先经太高压冷冻或液氮泥法子施行冷冻中止，尔后在冷冻前提下传输到真空溅射仪中施行断裂，显露样本新鲜的断裂面，并依据样本环境施行升华防备表面被冰包覆，以后施行导电性喷涂，至此制样完竣，经历冷冻传输系统将样本置于扫描电镜的冷台施行观测。解析测试中央电镜组现有的冷冻扫描电镜系统包罗高压冷冻仪LeicaEMHPM、冷冻传输样本杆LeicaEMVCT、离子溅射仪LeicaEMACE、克己的液氮泥冷冻安设、冷冻扫描电镜用的冷台。

高压冷冻仪

LeicaEMHPMLeica冷冻传输样本杆离子溅射仪冷冻扫描电镜冷台液氮泥冷冻安设LeicaEMVCTLeicaEMACENitrogenslushfreezer

2.1冷冻中止

2.1.1高压冷冻中止

冷冻中止的指标是在低温下使液态样本中的水不结晶而呈玻璃态，如此既能将样本在液相的形态中止，又防备了水结晶引发样本布局的摧残。因而，冷冻中止的关键是要阻遏冰晶造成，冷冻中止能否胜利，取决于冷冻过程疾速经历一个温度领域，即水着手结晶的温度到着手重结晶的温度区间，此区间受处境压力、样本浓度等成分的影响。如图1[1]所示，第一行是常压下的纯水，从K着手结晶，因思索到过冷水的影响，是以从K着手结晶，当温度低于重结晶温度K时，结晶过程中止。第二行是常压下的样本，时常样本包罗溶质会消沉样本的熔点（与溶质浓度联系连），同时升高重结晶温度，使得结晶的温度区间减小。第三行是施加.5MPa压力的样本，也许看出，施加高压会进一步消沉样本的熔点且升高重结晶的，是以结晶的温度区间进一步减小。

因而，可用高压冷冻的方法将液态样本施行加紧冷冻中止，详细如图2[1]所示，在10ms内，压力由常压霎时抬高至约MPa，同时用液氮使样本温度疾速降落，当经历水的结晶区间，直到温度低于约K后，即造成玻璃态的水。关于μm[3]厚的样本，样本中央地域经历这一温度区间大略需求30ms。

详细操纵过程以下，用移液枪将待测样本滴入冷冻样本夹片的下片，下片中有凹槽，可贮存肯定量的液体样本，尔后关上夹片上片，构成一个三明治布局，高低两片的材质均为铜镀金，以后将载有样本的全面夹片置于绿色的中止片上，推入高压冷冻仪中便可施行高压冷冻中止（图3），屡屡施行一次高压冷冻，仪器会生成一条冷冻弧线，依据弧线中抵达指标压力和温度的功夫可开头决断冷冻中止的成效。

2.1.2液氮泥冷冻中止

高压冷冻中止的法子固然能较好的使水中止在玻璃态，然则高压会影响某些样本的宏观布局，并且高压冷冻仪价钱昂贵。还可运用液氮方法施行冷冻中止，行将液氮置于真地面，在肯定的负压下（时常Pa）[3]，液氮由液态逐突变成固态，造成液氮泥。由于莱顿弗罗斯殊效应（指液体不会潮湿闷热的表面，而只是在其上造成一个蒸汽层的局面），当直接将样本放入液氮中时，样本四周的液氮会当即沸腾，将样本包裹在绝缘的氮气中，进而使样本不能当即降温，水成为结晶态。而将样本置于液氮泥中，由于液氮泥不存在沸腾局面，是以样本不会收到莱顿弗罗斯殊效应的影响，可疾速降温通，使得水份子来不及重排成晶体，进而造成玻璃态的水。倘使是液体样本，可用夹片承载样本直接投入到液氮泥中施行冷冻中止，固体样本则可直接用低温胶粘在样本台上投入液氮泥中施行中止。

2.2冷冻断裂/喷涂

将运用高压冷冻或液氮泥冷冻中止的样本在液氮中迁徙至冷冻样本台承载安设中，在此中将冷冻好的样本承载于冷冻传输样本杆上。尔后经历冷冻传输样本杆将载有样本的样本台迁徙至EMACE溅射仪中（图4）运用溅射仪中的刀对样本施行冷冻断裂，显露样本新鲜的断面，关于有些样本，在K下施行升华，防备样本被水包裹笼罩，以后施行导电性喷涂，防备在扫描电镜观测过程中放电局面的产生(图5）。

2.3冷冻扫描电镜观测

经历冷冻传输样本杆将断裂、喷涂好的样本迁徙至扫描电镜的冷台，冷台是由液氮降温经铜带导温来遏制温度（K），在扫描电镜观测时，时常运用较低的加快电压和较小的束流，以削弱放电局面和电子束对样本的损伤。由于全面传输及观测过程都维持在低温形态，是以尽也许的维持了样本在液相的原位布局。

3.冷冻扫描电镜的运用实例

3.1微乳液

图6为微乳液样本离别经高压冷冻和液氮泥冷冻中止，并经冷冻断裂/喷涂后，传输到冷冻扫描电镜获得的描写图，也许看出冷冻法子也许维持乳液中液滴的布局，液滴巨细不一，2μm至20μm。然则运用高压冷冻法子制得的样本，液滴呈椭球型，也许是由于液滴受高压挤压而变形而至，而运用液氮泥制样获得的样本液滴呈球型，维持了其原本的描写。

3.2纳米片安稳的水包油编制

图7为用纳米片安稳的微乳液经液氮泥冷冻中止、并经冷冻断裂/喷涂后，传输到冷冻扫描电镜获得的描写图，也许看出纳米片包覆在油滴表面，并且沿肯定的方位布列，据此也许得出纳米片在水包油安稳编制中的存在形态，进而料到安稳机理。

图7为用纳米片安稳的微乳液经液氮泥冷冻中止、并经冷冻断裂/喷涂后，传输到冷冻扫描电镜获得的描写图，也许看出纳米片包覆在油滴表面，并且沿肯定的方位布列，据此也许得出纳米片在水包油安稳编制中的存在形态，进而料到安稳机理。

3.3磷脂、二肽分子自组装体

图8是磷脂、二肽分子自组装体经液氮泥冷冻中止并经冷冻断裂/喷涂后，传输到冷冻扫描电镜获得的描写图，也许看出分子组装成棒状布局，棒的粗细在nm，每根棒又是由多根纤维构成。

3.4水凝胶

图9是水凝胶离别经历冷冻枯燥以后在常温扫描电镜上观测到的描写图和经液氮泥冷冻中止并经冷冻断裂/喷涂后，传输到冷冻扫描电镜获得的描写图。也许看出冷冻枯燥的水凝胶孔径较大且荒芜，也许是由于水份在真地面蒸发后样本由于没有水份的填充以致孔陷落。而未经历也许看出孔径很小且浓厚，由于真空枯燥的水凝胶在冷冻中止的光阴有水份填充，不会以致样本陷落，因而冷冻扫描电镜的法子维持了水凝胶自身的布局。

参考文件

[1]Dimitri,Vanhecke.;Werner,Graber.;DanielStuder.Methodsincellbiology.8,88.

[2]Pederson,R.C.;Miller,C.D.;Arvidson,J.M.;Blount,K.;Schulze,M.AdvancesinCryogenicEngineeringMaterials.NewYork:SpringerUS,.

[3]Kanno,H.;Speedy,R.J.andAngell,C.A.Science,,,.

道谢

谢谢解析测试中央丁丽萍教员对稿件的屡次审读和编纂加工！

谢谢解析测试中央袁震教员在冷冻扫描电镜尝试过程中关于清除仪器障碍的辅助！

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本文转载自中科院化学所解析测试中央，材料牛编纂整顿。

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